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Host–Guest Protein Assembly for Affinity Purification of Methyllysine Proteomes Li et al. - 2020 - Host–Guest Protein Assembly for Affinity Purification of Methyllysine Proteomes.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 蛋白质 - 蛋白质相互作用驱动生物大分子的自组装，从而在细胞水平上实现重要的生理功能，而人工宿主 - 客体相互作用可形成超分子复合物，但用超分子复合物模拟蛋白质复合物的功能仍具挑战。 葫芦脲[7]（CB[7]）能与某些肽的N末端特异性结合，研究人员利用这一特性构建了蛋白质组装体，并应用于蛋白质纯化等领域。 亲和纯化 - 质谱（AP - MS）常用于分析蛋白质的翻译后修饰（PTMs），bait蛋白在亲和纯化中成功固定是关键，但其非共价固定可能会屏蔽bait蛋白的某些结构域，导致信号丢失，且洗脱结合的蛋白质通常需要使用苛刻的条件。 实验内容： 构建超分子蛋白质探针： 合成并共价固定CB[7]衍生物于NHS树脂，设计包含N末端Phe - Gly - Gly（FGG）基序的肽，通过CB[7]与N末端Phe的非共价相互作用将肽锚定在树脂上，再与HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白反应，实现HP1β CD结构域在树脂表面的固定展示，形成超分子蛋白质探针。 通过荧光实验证明肽 - CB[7]树脂的形成，且CB[7]树脂对HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白的负载效率与单域蛋白PLCγ1 - c - SH2相当。 超分子蛋白质探针的亲和下拉实验： HP1β CD对甲基化蛋白质具有亲和力，表面展示HP1β CD的超分子蛋白质探针可用于富集和鉴定甲基化蛋白质。 实验表明超分子蛋白质探针能有效下拉甲基赖氨酸蛋白，背景信号低，且与Ni - NTA策略的下拉效率相当。 鉴定赖氨酸甲基化位点： 通过免疫沉淀和质谱分析，从Hela细胞裂解液中鉴定出255种独特蛋白质和66种不同的赖氨酸甲基化蛋白质，共101个甲基赖氨酸位点。 与之前的方法相比，该策略鉴定出的赖氨酸甲基化蛋白质数量显著增加，还发现了一些已知和新的非组蛋白上的赖氨酸甲基化位点，如RPA1 K331的新三甲基化位点，提示赖氨酸甲基化可能与RPA的泛素化有关，调控DNA损伤反应。 鉴定的赖氨酸甲基化肽中，甘氨酸在上游位置富集，未发现明显的通用甲基化位点 motif。 伴随的赖氨酸甲基化蛋白质分析： 对鉴定的赖氨酸甲基化蛋白质进行基因本体（GO）和KEGG通路功能富集分析，发现它们主要富集在细胞核中，参与表观遗传相关的生物过程，涉及15条显著富集的生物学通路。 这些蛋白质与其他修饰蛋白质存在相互作用，甲基化与乙酰化和泛素化的连接性更好。 结论： 首次将葫芦脲超分子化学应用于赖氨酸甲基化的蛋白质组学研究，通过共价蛋白反应和位点特异性CB[7] - 肽相互作用，实现了HP1β CD结构域的位点特异性、均匀展示，以及在完全天然条件下小分子竞争性驱动洗脱结合的甲基赖氨酸蛋白，简化了洗脱步骤，降低了背景，确保了高信噪比。 该方法有望在蛋白质诱饵的固定中普遍适用，新发现的含甲基赖氨酸的蛋白质、新的甲基赖氨酸位点及其参与的生物学通路将为生物学家提供启示，对未来研究蛋白质赖氨酸甲基化的功能具有重要意义。 方法： 材料和仪器：材料包括CB[7]、Fmoc保护的氨基酸、Rink酰胺树脂等；仪器包括RP - HPLC、MALDI - TOF质谱仪、凝胶成像系统等。 合成CB[7] - NH2：通过一系列反应从葫芦脲合成CB[7] - NH2。 肽合成：采用固相肽合成技术合成肽。 HP1β CD - PLCγ1 - SH2融合蛋白的制备：通过DNA重组技术将HP1β CD - PLCγ1 - SH2质粒插入大肠杆菌表达载体，诱导表达并纯化蛋白。 Hela细胞裂解及蛋白质下拉：使用HP1β CD-PLCγ1-c-SH2-肽-CBx
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Histone tyrosine sulfation by SULT1B1 regulates H4R3me2a and gene transcription Yu et al. - 2023 - Histone tyrosine sulfation by SULT1B1 regulates H4R3me2a and gene transcription.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 组蛋白的翻译后修饰（PTMs）协同调节染色质结构和功能，对基因表达、DNA损伤修复等生物过程至关重要，其失调与癌症等疾病有关。 磷酸化是组蛋白酪氨酸残基上常见的PTMs，而酪氨酸磺化（Ysulf）此前被认为仅存在于分泌蛋白和跨膜蛋白中，对核蛋白上的酪氨酸磺化知之甚少。 实验内容： 鉴定组蛋白酪氨酸磺化这一新的组蛋白修饰： 通过HPLC - MS / MS鉴定出HepG2细胞中组蛋白H3酪氨酸99（H3Y99sulf）发生磺化修饰，且与H3Y99phos不同。 开发出针对H3Y99sulf的抗体，在不同人细胞系中检测到H3Y99sulf的存在。 通过CUT&Tag - seq测定，在HepG2细胞中鉴定出9123个H3Y99sulf峰，主要分布在基因启动子区域，可能与基因转录有关。 探究H3Y99sulf的催化酶： 排除TPST1和TPST2是H3Y99sulf的催化酶，推测SULT家族成员可能催化H3Y99sulf的形成。 通过敲低实验，确定SULT1B1是细胞中H3Y99sulf的主要催化酶，且能在体外直接将H3Y99sulf沉积在组蛋白H3上。 模拟SULT1B1与组蛋白H3的相互作用，发现单体组蛋白H3是SULT1B1沉积H3Y99sulf的底物。 研究H3Y99sulf在细胞中的定位： 通过分子建模和实验验证，发现H3Y99sulf位于亚核小体结构（如四聚体和六聚体）的表面，可被H3Y99sulf抗体识别和结合。 探究H3Y99sulf对H4R3me2a的调控作用： 合成与H3Y99局部α螺旋序列相同的生物素标记肽段，通过核提取物结合实验和蛋白质组学分析，鉴定出PRMT1是H3Y99sulf的结合蛋白。 免疫沉淀和细胞 - 自由结合实验证实PRMT1能被H3Y99sulf富集，且H3Y99sulf增强了PRMT1与组蛋白H3的结合以及对四聚体和六聚体的结合。 进一步研究发现，SULT1B1介导的H3Y99sulf通过招募PRMT1在染色质中沉积H4R3me2a，且PRMT1利用Asn - 218和Ser - 225之间的环来识别H3Y99sulf。 验证H3Y99sulf对基因转录的调节作用： H3Y99sulf主要分布在基因启动子区域，与PRMT1和H4R3me2a在基因启动子区域存在关联，其缺失会减少H4R3me2a在基因启动子区域的分布，降低相关基因的mRNA和蛋白表达。 讨论与结论： H3Y99磺化和磷酸化的区别：H3Y99磺化和磷酸化发生的阶段、调节方式、去除机制以及阅读分子集都不同。 H3Y99sulf对H3 - H4异二聚体化的影响：虽然H3Y99sulf可能影响H3 - H4异二聚体化，但它仍能在染色质中发挥作用。 H3Y99sulf - PRMT1 - H4R3me2a轴的意义：H3Y99sulf可能通过调节H4R3me2a的下游功能影响细胞过程，如破坏H3Y99sulf可能导致R - loop积累，但需进一步验证。 PRMT1 - （218 - 225） - 突变体的结构变化：PRMT1 - （218 - 225） - 突变体的活性降低，可能存在结构变化，但具体机制需通过晶体结构分析来揭示。
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High-affinity chromodomains engineered Veggiani 等 - 2022 - High-affinity chromodomains engineered for improved detection of histone methylation and enhanced CR.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 蛋白质甲基化是一种重要的翻译后修饰，其失调与多种疾病相关，但研究甲基化的抗体存在局限性，而染色质修饰阅读器域（如chromodomains）的亲和力和特异性有限。 此前的研究主要集中在增强HP1 chromodomains的亲和力，本研究则致力于提高Cbx7 chromodomain对H3K27me3的亲和力。 实验内容： 开发高亲和力的Cbx7 chromodomain变体： 设计和构建噬菌体展示库：选择Cbx7 - chromo进行改造，通过对与甲基赖氨酸结合口袋相关的两个连续区域进行软随机诱变，构建了包含1.1×10^10个独特Cbx7 - chromo变体的噬菌体展示库。 筛选和鉴定变体：经过五轮结合选择和一轮阴性选择，鉴定出六个独特的Cbx7变体，其中Cbx7.V1表现出最强的H3K27me3肽结合信号且不含半胱氨酸残基，因此被重点研究。 定点突变和亲和力测定：对Cbx7.V1进行定点突变，发现D9Q和E33K的回复突变导致亲和力大幅降低，而将D9Q和E33K分别引入野生型Cbx7 - chromo（Cbx7.wt）中可提高亲和力，且含有双突变Q9D / K33E的变体（Cbx7.VD）表现出更高的亲和力且不改变甲基赖氨酸特异性。 探究Asp9 / Glu33双取代对人Cbx chromodomain家族的影响： 序列分析和结构模拟：分析其他Cbx chromodomains的序列，发现大多数在对应位置具有相似的氨基酸残基，且结构模拟显示这些残基的位置相对保守，推测Asp9 / Glu33取代可能增强其他Cbx chromodomains的亲和力。 亲和力和特异性测定：对所有Cbx chromodomains进行Asp9 / Glu33取代并测定其与甲基化肽段的亲和力和特异性，结果表明除Cbx4外，大多数chromodomains的亲和力得到增强，且不改变特异性。 在mESCs中对高亲和力chromodomains进行功能表征： 细胞实验：将Cbx3.wt、Cbx3.VD、Cbx5.wt、Cbx5.VD、Cbx7.VD或Cbx2.VD整合到小鼠胚胎干细胞（mESCs）基因组中，通过活细胞成像和流式细胞术分析，发现工程化的高亲和力chromodomains在活细胞中与H3K27me3标记有强结合，同时保持了野生型对应物的结合特异性。 基因组结合分析：通过生物素介导的染色质免疫沉淀测序（biotin ChIP - seq），发现高亲和力的单域和双域蛋白在H3K27me3位点有特定的富集，且双域版本显示出更强的富集。 高亲和力chromodomains对CRISPRi效率的影响： 实验设计：将每个Cbx chromodomain（除Cbx4外）及其高亲和力变体与KOX1的KRAB域融合到dCas9的N末端，评估它们在HEK293T pSV40 - EGFP报告细胞系中沉默EGFP表达的能力。 结果分析：几乎所有Cbx - KOX1 - dCas9融合蛋白都比单独的KOX1 - dCas9更能有效地降低EGFP表达，且抑制程度与chromodomains对H3K9me3和H3K27me3标记的亲和力密切相关。进一步研究发现，Cbx3.VD - KOX1 - dCas9是一种高效的转录抑制因子，将Cbx3.VD与ZIM3的KRAB域融合可进一步提高转录抑制能力。 讨论与结论： 本研究提出了一种增强PcG和HP1家族chromodomains亲和力的模块化策略，且不影响其在体外和体内的特异性。 通过噬菌体展示库筛选出关键的氨基酸取代，极大地提高了chromodomains对H3K9me3和H3K27me3肽的结合能力，确定了两个对亲和力增强至关重要的取代（Q9D / K33E），且这两个取代增强了大多数
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Epigenetics and beyond: targeting writers of protein lysine Bhat et al. - 2021 - Epigenetics and beyond targeting writers of protein lysine methylation to treat disease.pdf AI总结 文章总结： 引言： 蛋白质赖氨酸甲基化是一种重要的翻译后修饰，其调节着组蛋白和非组蛋白的功能，赖氨酸甲基转移酶（KMTs）的失调与许多疾病有关，包括癌症、精神健康障碍和发育障碍等。 2020年，tazemetostat成为首个获FDA批准的KMT抑制剂，用于治疗上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤，还有更多抑制剂正在临床和临床前评估中。 writers of lysine methylation（赖氨酸甲基化的写入者）： 两类具有KMT活性的蛋白质域家族：SET域（约60%的含SET域蛋白具有明确的甲基化活性）和7βS域（DOT1L和KMT9催化组蛋白赖氨酸甲基化，其他一些酶甲基化细胞质蛋白）。 临床相关的组蛋白甲基化位点：H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20和H4K12等。 治疗靶点的基本原理：KMTs表面至少有两个可用于化学靶向的不同口袋，即甲基供体S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）的辅因子结合位点和赖氨酸底物结合口袋，大多数KMTs具有高度的底物特异性，且一些与癌症相关的KMTs存在染色体易位、增益功能突变和基因扩增等情况，有利于药物开发和患者选择。 开发KMT抑制剂的一般化学考虑和策略：许多现有的KMT抑制剂是底物竞争者，SAM - 竞争性抑制剂的主要问题不是选择性，而是亲水性差，可能导致细胞渗透性差，但已开发出具有良好细胞渗透性的SAM - 竞争性临床级抑制剂；结构信息有助于理解酶的选择性，从而推动新临床候选抑制剂的发现。 EZH2抑制剂： EZH2的生物学特性和临床背景：EZH2是Polycomb抑制复合物2（PRC2）的主要催化亚基，催化H3K27甲基化以抑制基因转录；EZH2在多种癌症中过表达，其突变与淋巴瘤等疾病相关；此外，一些癌症类型依赖于升高的H3K27me3水平，对EZH2抑制剂敏感。 化学和结构考虑：多种强效和选择性的PRC2 - EZH2抑制剂被报道，如tazemetostat、GSK126、CPI - 1205和PF - 06821497等，它们大多含有吡啶酮核心，是SAM - 竞争性抑制剂；药物开发受益于结构信息，如PRC2与底物和抑制剂的复合物结构揭示了EZH2与其他亚基的相互作用以及抑制剂的作用机制。 临床结果：tazemetostat已获FDA批准用于治疗上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤，其他EZH2抑制剂在临床试验中也显示出一定的疗效，但仍需进一步研究以确定最佳的治疗方案和患者群体。 替代治疗策略：靶向PRC2的其他功能重要且可成药的组件，如干扰EED与H3K27me3的相互作用或阻断DOT1L与其结合伴侣的相互作用，可能是一种可行的临床治疗策略。 未来应用和挑战：EZH2在癌症发病机制中具有两面性，在不同癌症类型中作用不同，且其对肿瘤免疫逃避和免疫治疗耐药性的影响复杂，需要仔细的患者分层；未来EZH2抑制剂的应用可能扩展到血液和实体肿瘤，且新一代抑制剂可能有助于与其他治疗方法的联合应用。 DOT1L抑制剂： DOT1L的生物学特性：DOT1L是唯一已知的催化H3K79甲基化的酶，该修饰与转录激活相关，DOT1L在胚胎发育、造血和心血管系统中至关重要，其失调驱动一部分儿童白血病。 临床背景：DOT1L活动和H3K79二甲基化是某些血液恶性肿瘤（如MLL - r白血病）发生的重要驱动因素，MLL基因融合导致DOT1L的异常定位和H3K79甲基化增加，从而促进肿瘤发生。 化学和结构考虑：EPZ004777和pinometostat等抑制剂基于DOT1L的辅因子产物SAH和酶活性位点的晶体结构设计，具有高 potency和选择性，与DOT1L的相互作用涉及特定的结构特征和口袋形成。
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Developmental Stage-dependent Regulation of Prolyl 3-Hydroxylation in Tendon Type I Collagen Taga et al. - 2016 - Developmental Stage-dependent Regulation of Prolyl 3-Hydroxylation in Tendon Type I Collagen.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 3 - 羟基脯氨酸（3 - Hyp）是胶原特有的一种罕见的翻译后修饰，其生理作用尚不清楚，但近期研究表明其在原纤维组装中具有功能，并与某些疾病相关。 目前对3 - Hyp的生理和病理作用尚无直接证据，且关于年龄对其影响的研究较少。 实验方法： 提取和纯化组织胶原：从不同月龄的大鼠皮肤、骨骼和尾肌腱以及牛的跟腱中提取和纯化胶原。 制备稳定同位素标记的胶原（SI - collagen）：从成纤维细胞培养物中制备，作为内部标准用于高精度胶原分析。 总胶原脯氨酸3 - 羟基化分析：通过LC - MS分析酸水解后的胶原样品，以SI - collagen为内标，计算3 - Hyp的相对含量和绝对含量。 位点特异性分析：对胶原样品进行胰蛋白酶消化，通过LC - MS分析胰蛋白酶肽段，鉴定3 - Hyp位点，并半定量估计每个修饰位点脯氨酸3 - 羟基化的相对丰度。 N - 末端氨基酸序列分析：对含有新鉴定的3 - Hyp位点的胰蛋白酶肽段进行N - 末端氨基酸序列分析，以验证3 - Hyp的存在。 实验结果： 3 - Hyp在肌腱胶原中增加：在大鼠尾肌腱胶原中，3 - Hyp在出生后3个月内显著增加，随后保持稳定，而皮肤和骨骼胶原中未观察到明显增加。 发现肌腱中I型胶原的新3 - Hyp位点：通过LC - MS在大鼠尾肌腱I型胶原中鉴定出Pro716和Pro719为新的3 - Hyp位点，并验证了其存在。 脯氨酸3 - 羟基化在肌腱I型胶原特定位点增加：在大鼠尾肌腱I型胶原中，Pro986几乎完全羟基化，而Pro707、Pro716和Pro719的脯氨酸3 - 羟基化水平在幼鼠和成年鼠之间存在显著差异，且在幼龄时显著增加。皮肤和骨骼I型胶原中未检测到Pro716和Pro719的羟基化。牛肌腱中也观察到了类似的脯氨酸3 - 羟基化随年龄的变化。 确保肌腱胶原样品的纯度：通过监测I型胶原α2链中Pro891的潜在羟基化情况，确认了肌腱样品为纯肌腱胶原。 讨论： 3 - Hyp在大鼠尾肌腱中在特定年龄段的连续修饰位点（包括Pro707、Pro716和Pro719）显著增加，这种增加与肌腱的组织发育相关，而不是与衰老相关。 3 - Hyp可能参与胶原原纤维的组装，对原纤维直径的调节起增量作用，肌腱中独特的组织特异性特性可能部分源于发育早期脯氨酸3 - 羟基化的改变。 推测Pro716和Pro719由P3H2在Pro707羟基化后修饰，负责不同位点羟基化的P3H酶的差异可能导致了不同的结果。 皮肤、骨骼和尾肌腱中羟赖氨酸的糖基化也有显著变化，进一步的位点特异性分析可能会有新的发现。 3 - Hyp在胶原中的水平显示出个体变异性，且相对容易响应生理和病理条件而改变，可能负责结缔组织机械/结构特性的时间调节，其水平可能是组织胶原质量状态的指标。 结论：本研究表明脯氨酸3 - 羟基化在组织、发育阶段和修饰位点上具有特异性改变，暗示其在组织中起关键作用，但3 - Hyp增加在肌腱中的生物学意义仍有待阐明，需要进一步的研究。
