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研究背景：
- 蛋白质甲基化是一种重要的翻译后修饰，其失调与多种疾病相关，但研究甲基化的抗体存在局限性，而染色质修饰阅读器域（如chromodomains）的亲和力和特异性有限。
- 此前的研究主要集中在增强HP1 chromodomains的亲和力，本研究则致力于提高Cbx7 chromodomain对H3K27me3的亲和力。
实验内容：
开发高亲和力的Cbx7 chromodomain变体：
- 设计和构建噬菌体展示库：选择Cbx7 - chromo进行改造，通过对与甲基赖氨酸结合口袋相关的两个连续区域进行软随机诱变，构建了包含1.1×10^10个独特Cbx7 - chromo变体的噬菌体展示库。
- 筛选和鉴定变体：经过五轮结合选择和一轮阴性选择，鉴定出六个独特的Cbx7变体，其中Cbx7.V1表现出最强的H3K27me3肽结合信号且不含半胱氨酸残基，因此被重点研究。
- 定点突变和亲和力测定：对Cbx7.V1进行定点突变，发现D9Q和E33K的回复突变导致亲和力大幅降低，而将D9Q和E33K分别引入野生型Cbx7 - chromo（Cbx7.wt）中可提高亲和力，且含有双突变Q9D / K33E的变体（Cbx7.VD）表现出更高的亲和力且不改变甲基赖氨酸特异性。
探究Asp9 / Glu33双取代对人Cbx chromodomain家族的影响：
- 序列分析和结构模拟：分析其他Cbx chromodomains的序列，发现大多数在对应位置具有相似的氨基酸残基，且结构模拟显示这些残基的位置相对保守，推测Asp9 / Glu33取代可能增强其他Cbx chromodomains的亲和力。
- 亲和力和特异性测定：对所有Cbx chromodomains进行Asp9 / Glu33取代并测定其与甲基化肽段的亲和力和特异性，结果表明除Cbx4外，大多数chromodomains的亲和力得到增强，且不改变特异性。
在mESCs中对高亲和力chromodomains进行功能表征：
- 细胞实验：将Cbx3.wt、Cbx3.VD、Cbx5.wt、Cbx5.VD、Cbx7.VD或Cbx2.VD整合到小鼠胚胎干细胞（mESCs）基因组中，通过活细胞成像和流式细胞术分析，发现工程化的高亲和力chromodomains在活细胞中与H3K27me3标记有强结合，同时保持了野生型对应物的结合特异性。
- 基因组结合分析：通过生物素介导的染色质免疫沉淀测序（biotin ChIP - seq），发现高亲和力的单域和双域蛋白在H3K27me3位点有特定的富集，且双域版本显示出更强的富集。
高亲和力chromodomains对CRISPRi效率的影响：
- 实验设计：将每个Cbx chromodomain（除Cbx4外）及其高亲和力变体与KOX1的KRAB域融合到dCas9的N末端，评估它们在HEK293T pSV40 - EGFP报告细胞系中沉默EGFP表达的能力。
- 结果分析：几乎所有Cbx - KOX1 - dCas9融合蛋白都比单独的KOX1 - dCas9更能有效地降低EGFP表达，且抑制程度与chromodomains对H3K9me3和H3K27me3标记的亲和力密切相关。进一步研究发现，Cbx3.VD - KOX1 - dCas9是一种高效的转录抑制因子，将Cbx3.VD与ZIM3的KRAB域融合可进一步提高转录抑制能力。
讨论与结论：
- 本研究提出了一种增强PcG和HP1家族chromodomains亲和力的模块化策略，且不影响其在体外和体内的特异性。
- 通过噬菌体展示库筛选出关键的氨基酸取代，极大地提高了chromodomains对H3K9me3和H3K27me3肽的结合能力，确定了两个对亲和力增强至关重要的取代（Q9D / K33E），且这两个取代增强了大多数
