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Histone tyrosine sulfation by SULT1B1 regulates H4R3me2a and gene transcription Yu et al. - 2023 - Histone tyrosine sulfation by SULT1B1 regulates H4R3me2a and gene transcription.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 组蛋白的翻译后修饰（PTMs）协同调节染色质结构和功能，对基因表达、DNA损伤修复等生物过程至关重要，其失调与癌症等疾病有关。 磷酸化是组蛋白酪氨酸残基上常见的PTMs，而酪氨酸磺化（Ysulf）此前被认为仅存在于分泌蛋白和跨膜蛋白中，对核蛋白上的酪氨酸磺化知之甚少。 实验内容： 鉴定组蛋白酪氨酸磺化这一新的组蛋白修饰： 通过HPLC - MS / MS鉴定出HepG2细胞中组蛋白H3酪氨酸99（H3Y99sulf）发生磺化修饰，且与H3Y99phos不同。 开发出针对H3Y99sulf的抗体，在不同人细胞系中检测到H3Y99sulf的存在。 通过CUT&Tag - seq测定，在HepG2细胞中鉴定出9123个H3Y99sulf峰，主要分布在基因启动子区域，可能与基因转录有关。 探究H3Y99sulf的催化酶： 排除TPST1和TPST2是H3Y99sulf的催化酶，推测SULT家族成员可能催化H3Y99sulf的形成。 通过敲低实验，确定SULT1B1是细胞中H3Y99sulf的主要催化酶，且能在体外直接将H3Y99sulf沉积在组蛋白H3上。 模拟SULT1B1与组蛋白H3的相互作用，发现单体组蛋白H3是SULT1B1沉积H3Y99sulf的底物。 研究H3Y99sulf在细胞中的定位： 通过分子建模和实验验证，发现H3Y99sulf位于亚核小体结构（如四聚体和六聚体）的表面，可被H3Y99sulf抗体识别和结合。 探究H3Y99sulf对H4R3me2a的调控作用： 合成与H3Y99局部α螺旋序列相同的生物素标记肽段，通过核提取物结合实验和蛋白质组学分析，鉴定出PRMT1是H3Y99sulf的结合蛋白。 免疫沉淀和细胞 - 自由结合实验证实PRMT1能被H3Y99sulf富集，且H3Y99sulf增强了PRMT1与组蛋白H3的结合以及对四聚体和六聚体的结合。 进一步研究发现，SULT1B1介导的H3Y99sulf通过招募PRMT1在染色质中沉积H4R3me2a，且PRMT1利用Asn - 218和Ser - 225之间的环来识别H3Y99sulf。 验证H3Y99sulf对基因转录的调节作用： H3Y99sulf主要分布在基因启动子区域，与PRMT1和H4R3me2a在基因启动子区域存在关联，其缺失会减少H4R3me2a在基因启动子区域的分布，降低相关基因的mRNA和蛋白表达。 讨论与结论： H3Y99磺化和磷酸化的区别：H3Y99磺化和磷酸化发生的阶段、调节方式、去除机制以及阅读分子集都不同。 H3Y99sulf对H3 - H4异二聚体化的影响：虽然H3Y99sulf可能影响H3 - H4异二聚体化，但它仍能在染色质中发挥作用。 H3Y99sulf - PRMT1 - H4R3me2a轴的意义：H3Y99sulf可能通过调节H4R3me2a的下游功能影响细胞过程，如破坏H3Y99sulf可能导致R - loop积累，但需进一步验证。 PRMT1 - （218 - 225） - 突变体的结构变化：PRMT1 - （218 - 225） - 突变体的活性降低，可能存在结构变化，但具体机制需通过晶体结构分析来揭示。
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High-affinity chromodomains engineered Veggiani 等 - 2022 - High-affinity chromodomains engineered for improved detection of histone methylation and enhanced CR.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 蛋白质甲基化是一种重要的翻译后修饰，其失调与多种疾病相关，但研究甲基化的抗体存在局限性，而染色质修饰阅读器域（如chromodomains）的亲和力和特异性有限。 此前的研究主要集中在增强HP1 chromodomains的亲和力，本研究则致力于提高Cbx7 chromodomain对H3K27me3的亲和力。 实验内容： 开发高亲和力的Cbx7 chromodomain变体： 设计和构建噬菌体展示库：选择Cbx7 - chromo进行改造，通过对与甲基赖氨酸结合口袋相关的两个连续区域进行软随机诱变，构建了包含1.1×10^10个独特Cbx7 - chromo变体的噬菌体展示库。 筛选和鉴定变体：经过五轮结合选择和一轮阴性选择，鉴定出六个独特的Cbx7变体，其中Cbx7.V1表现出最强的H3K27me3肽结合信号且不含半胱氨酸残基，因此被重点研究。 定点突变和亲和力测定：对Cbx7.V1进行定点突变，发现D9Q和E33K的回复突变导致亲和力大幅降低，而将D9Q和E33K分别引入野生型Cbx7 - chromo（Cbx7.wt）中可提高亲和力，且含有双突变Q9D / K33E的变体（Cbx7.VD）表现出更高的亲和力且不改变甲基赖氨酸特异性。 探究Asp9 / Glu33双取代对人Cbx chromodomain家族的影响： 序列分析和结构模拟：分析其他Cbx chromodomains的序列，发现大多数在对应位置具有相似的氨基酸残基，且结构模拟显示这些残基的位置相对保守，推测Asp9 / Glu33取代可能增强其他Cbx chromodomains的亲和力。 亲和力和特异性测定：对所有Cbx chromodomains进行Asp9 / Glu33取代并测定其与甲基化肽段的亲和力和特异性，结果表明除Cbx4外，大多数chromodomains的亲和力得到增强，且不改变特异性。 在mESCs中对高亲和力chromodomains进行功能表征： 细胞实验：将Cbx3.wt、Cbx3.VD、Cbx5.wt、Cbx5.VD、Cbx7.VD或Cbx2.VD整合到小鼠胚胎干细胞（mESCs）基因组中，通过活细胞成像和流式细胞术分析，发现工程化的高亲和力chromodomains在活细胞中与H3K27me3标记有强结合，同时保持了野生型对应物的结合特异性。 基因组结合分析：通过生物素介导的染色质免疫沉淀测序（biotin ChIP - seq），发现高亲和力的单域和双域蛋白在H3K27me3位点有特定的富集，且双域版本显示出更强的富集。 高亲和力chromodomains对CRISPRi效率的影响： 实验设计：将每个Cbx chromodomain（除Cbx4外）及其高亲和力变体与KOX1的KRAB域融合到dCas9的N末端，评估它们在HEK293T pSV40 - EGFP报告细胞系中沉默EGFP表达的能力。 结果分析：几乎所有Cbx - KOX1 - dCas9融合蛋白都比单独的KOX1 - dCas9更能有效地降低EGFP表达，且抑制程度与chromodomains对H3K9me3和H3K27me3标记的亲和力密切相关。进一步研究发现，Cbx3.VD - KOX1 - dCas9是一种高效的转录抑制因子，将Cbx3.VD与ZIM3的KRAB域融合可进一步提高转录抑制能力。 讨论与结论： 本研究提出了一种增强PcG和HP1家族chromodomains亲和力的模块化策略，且不影响其在体外和体内的特异性。 通过噬菌体展示库筛选出关键的氨基酸取代，极大地提高了chromodomains对H3K9me3和H3K27me3肽的结合能力，确定了两个对亲和力增强至关重要的取代（Q9D / K33E），且这两个取代增强了大多数
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Epigenetics and beyond: targeting writers of protein lysine Bhat et al. - 2021 - Epigenetics and beyond targeting writers of protein lysine methylation to treat disease.pdf AI总结 文章总结： 引言： 蛋白质赖氨酸甲基化是一种重要的翻译后修饰，其调节着组蛋白和非组蛋白的功能，赖氨酸甲基转移酶（KMTs）的失调与许多疾病有关，包括癌症、精神健康障碍和发育障碍等。 2020年，tazemetostat成为首个获FDA批准的KMT抑制剂，用于治疗上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤，还有更多抑制剂正在临床和临床前评估中。 writers of lysine methylation（赖氨酸甲基化的写入者）： 两类具有KMT活性的蛋白质域家族：SET域（约60%的含SET域蛋白具有明确的甲基化活性）和7βS域（DOT1L和KMT9催化组蛋白赖氨酸甲基化，其他一些酶甲基化细胞质蛋白）。 临床相关的组蛋白甲基化位点：H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20和H4K12等。 治疗靶点的基本原理：KMTs表面至少有两个可用于化学靶向的不同口袋，即甲基供体S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）的辅因子结合位点和赖氨酸底物结合口袋，大多数KMTs具有高度的底物特异性，且一些与癌症相关的KMTs存在染色体易位、增益功能突变和基因扩增等情况，有利于药物开发和患者选择。 开发KMT抑制剂的一般化学考虑和策略：许多现有的KMT抑制剂是底物竞争者，SAM - 竞争性抑制剂的主要问题不是选择性，而是亲水性差，可能导致细胞渗透性差，但已开发出具有良好细胞渗透性的SAM - 竞争性临床级抑制剂；结构信息有助于理解酶的选择性，从而推动新临床候选抑制剂的发现。 EZH2抑制剂： EZH2的生物学特性和临床背景：EZH2是Polycomb抑制复合物2（PRC2）的主要催化亚基，催化H3K27甲基化以抑制基因转录；EZH2在多种癌症中过表达，其突变与淋巴瘤等疾病相关；此外，一些癌症类型依赖于升高的H3K27me3水平，对EZH2抑制剂敏感。 化学和结构考虑：多种强效和选择性的PRC2 - EZH2抑制剂被报道，如tazemetostat、GSK126、CPI - 1205和PF - 06821497等，它们大多含有吡啶酮核心，是SAM - 竞争性抑制剂；药物开发受益于结构信息，如PRC2与底物和抑制剂的复合物结构揭示了EZH2与其他亚基的相互作用以及抑制剂的作用机制。 临床结果：tazemetostat已获FDA批准用于治疗上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤，其他EZH2抑制剂在临床试验中也显示出一定的疗效，但仍需进一步研究以确定最佳的治疗方案和患者群体。 替代治疗策略：靶向PRC2的其他功能重要且可成药的组件，如干扰EED与H3K27me3的相互作用或阻断DOT1L与其结合伴侣的相互作用，可能是一种可行的临床治疗策略。 未来应用和挑战：EZH2在癌症发病机制中具有两面性，在不同癌症类型中作用不同，且其对肿瘤免疫逃避和免疫治疗耐药性的影响复杂，需要仔细的患者分层；未来EZH2抑制剂的应用可能扩展到血液和实体肿瘤，且新一代抑制剂可能有助于与其他治疗方法的联合应用。 DOT1L抑制剂： DOT1L的生物学特性：DOT1L是唯一已知的催化H3K79甲基化的酶，该修饰与转录激活相关，DOT1L在胚胎发育、造血和心血管系统中至关重要，其失调驱动一部分儿童白血病。 临床背景：DOT1L活动和H3K79二甲基化是某些血液恶性肿瘤（如MLL - r白血病）发生的重要驱动因素，MLL基因融合导致DOT1L的异常定位和H3K79甲基化增加，从而促进肿瘤发生。 化学和结构考虑：EPZ004777和pinometostat等抑制剂基于DOT1L的辅因子产物SAH和酶活性位点的晶体结构设计，具有高 potency和选择性，与DOT1L的相互作用涉及特定的结构特征和口袋形成。
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Developmental Stage-dependent Regulation of Prolyl 3-Hydroxylation in Tendon Type I Collagen Taga et al. - 2016 - Developmental Stage-dependent Regulation of Prolyl 3-Hydroxylation in Tendon Type I Collagen.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 3 - 羟基脯氨酸（3 - Hyp）是胶原特有的一种罕见的翻译后修饰，其生理作用尚不清楚，但近期研究表明其在原纤维组装中具有功能，并与某些疾病相关。 目前对3 - Hyp的生理和病理作用尚无直接证据，且关于年龄对其影响的研究较少。 实验方法： 提取和纯化组织胶原：从不同月龄的大鼠皮肤、骨骼和尾肌腱以及牛的跟腱中提取和纯化胶原。 制备稳定同位素标记的胶原（SI - collagen）：从成纤维细胞培养物中制备，作为内部标准用于高精度胶原分析。 总胶原脯氨酸3 - 羟基化分析：通过LC - MS分析酸水解后的胶原样品，以SI - collagen为内标，计算3 - Hyp的相对含量和绝对含量。 位点特异性分析：对胶原样品进行胰蛋白酶消化，通过LC - MS分析胰蛋白酶肽段，鉴定3 - Hyp位点，并半定量估计每个修饰位点脯氨酸3 - 羟基化的相对丰度。 N - 末端氨基酸序列分析：对含有新鉴定的3 - Hyp位点的胰蛋白酶肽段进行N - 末端氨基酸序列分析，以验证3 - Hyp的存在。 实验结果： 3 - Hyp在肌腱胶原中增加：在大鼠尾肌腱胶原中，3 - Hyp在出生后3个月内显著增加，随后保持稳定，而皮肤和骨骼胶原中未观察到明显增加。 发现肌腱中I型胶原的新3 - Hyp位点：通过LC - MS在大鼠尾肌腱I型胶原中鉴定出Pro716和Pro719为新的3 - Hyp位点，并验证了其存在。 脯氨酸3 - 羟基化在肌腱I型胶原特定位点增加：在大鼠尾肌腱I型胶原中，Pro986几乎完全羟基化，而Pro707、Pro716和Pro719的脯氨酸3 - 羟基化水平在幼鼠和成年鼠之间存在显著差异，且在幼龄时显著增加。皮肤和骨骼I型胶原中未检测到Pro716和Pro719的羟基化。牛肌腱中也观察到了类似的脯氨酸3 - 羟基化随年龄的变化。 确保肌腱胶原样品的纯度：通过监测I型胶原α2链中Pro891的潜在羟基化情况，确认了肌腱样品为纯肌腱胶原。 讨论： 3 - Hyp在大鼠尾肌腱中在特定年龄段的连续修饰位点（包括Pro707、Pro716和Pro719）显著增加，这种增加与肌腱的组织发育相关，而不是与衰老相关。 3 - Hyp可能参与胶原原纤维的组装，对原纤维直径的调节起增量作用，肌腱中独特的组织特异性特性可能部分源于发育早期脯氨酸3 - 羟基化的改变。 推测Pro716和Pro719由P3H2在Pro707羟基化后修饰，负责不同位点羟基化的P3H酶的差异可能导致了不同的结果。 皮肤、骨骼和尾肌腱中羟赖氨酸的糖基化也有显著变化，进一步的位点特异性分析可能会有新的发现。 3 - Hyp在胶原中的水平显示出个体变异性，且相对容易响应生理和病理条件而改变，可能负责结缔组织机械/结构特性的时间调节，其水平可能是组织胶原质量状态的指标。 结论：本研究表明脯氨酸3 - 羟基化在组织、发育阶段和修饰位点上具有特异性改变，暗示其在组织中起关键作用，但3 - Hyp增加在肌腱中的生物学意义仍有待阐明，需要进一步的研究。
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Affinity Purification of Methyllysine Proteome by Site-Specific Covalent Conjugation Wang et al. - 2018 - Affinity Purification of Methyllysine Proteome by Site-Specific Covalent Conjugation.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 靶向蛋白质组学中，通过亲和纯化分离目标蛋白是关键步骤，通常将诱饵蛋白固定在固体支持物表面进行亲和纯化，但传统的固定方法存在一些问题，如非共价相互作用弱、抗体或亲和试剂的结合效率和特异性不一、直接共价偶联缺乏位点选择性等。 研究方法与内容： 设计位点特异性共价偶联反应： 利用磷脂酶Cγ1 C -末端SH2结构域（PLCγ1 - c - SH2）与工程配体肽PGFpYXEAN（来自PLCγ1的X - Y接头，X为带有α - 氯乙酰基的非天然氨基酸）之间的位点特异性共价偶联反应，PGFpYXEAN通过N末端氨基基团固定在NHS活化的琼脂糖树脂上，然后HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白通过SH2结构域与PGFpYXEAN反应，实现HP1β CD在琼脂糖表面的固定。 验证反应：将重组表达和纯化的PLCγ1 - c - SH2和配体肽在PBS中混合，通过质谱证实形成稳定的共价交联；对HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白与BC - k配体肽的反应动力学进行详细研究，发现咪唑能促进共轭反应，且反应具有特异性。 通过BC - k肽共价固定HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2： 将BC - k肽共价偶联到NHS功能化的琼脂糖树脂上，然后加入HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白进行共价偶联反应，量化结果表明融合蛋白中的SH2结构域能有效地与琼脂糖表面展示的BC - k肽反应，且表面展示的HP1β CD蛋白能够结合甲基化赖氨酸含蛋白质。 通过对比实验发现，与利用镍 - 次氮基三乙酸（Ni - NTA）琼脂糖锚定His标签的HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白的方法相比，AGCC共价固定化背景更低，能减少与裂解液蛋白质的非特异性相互作用，且共价锚定能有效防止表面展示蛋白质的泄漏，降低后续质谱分析中噪声肽的水平。 通过共价固定化策略分析MCF - 7细胞中的甲基化组： 利用AGCC展示的HP1β CD与MCF - 7细胞裂解液中HP1β CD蛋白相互作用，对亲和富集的蛋白质进行SDS - PAGE分析、凝胶内消化和质谱分析，鉴定出322种与HP1β CD相关的蛋白质，其中184种是赖氨酸甲基化（Kme）蛋白质，共鉴定出275个不同的赖氨酸甲基化位点，包括101个三甲基化位点、100个二甲基化位点和77个单甲基化位点。 与已知甲基化蛋白质数据库对比，发现AGCC策略能发现更多赖氨酸甲基化蛋白质和位点；对鉴定的赖氨酸甲基化蛋白质进行亚细胞定位和基序分析，发现细胞质蛋白质占多数，且甲基化赖氨酸位点没有明显的主导基序。 研究结论： 开发了基于亲和导向共价偶联（AGCC）的新蛋白质固定化策略，利用工程BC - k肽与PLCγ1 - c - SH2结构域之间的Cys - 氯乙酰基亲核S_N2反应，有效地固定了HP1β CD作为诱饵，用于甲基化赖氨酸蛋白质的蛋白质组分析。 AGCC策略使诱饵蛋白具有均匀的取向，同时保持其结构和活性，有助于生物偶联在AP / MS研究中的应用，推动了蛋白质固定化方法的进步，加速了对更多表观遗传功能的理解。 文献
