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Affinity Purification of Methyllysine Proteome by Site-Specific Covalent Conjugation Wang et al. - 2018 - Affinity Purification of Methyllysine Proteome by Site-Specific Covalent Conjugation.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 靶向蛋白质组学中，通过亲和纯化分离目标蛋白是关键步骤，通常将诱饵蛋白固定在固体支持物表面进行亲和纯化，但传统的固定方法存在一些问题，如非共价相互作用弱、抗体或亲和试剂的结合效率和特异性不一、直接共价偶联缺乏位点选择性等。 研究方法与内容： 设计位点特异性共价偶联反应： 利用磷脂酶Cγ1 C -末端SH2结构域（PLCγ1 - c - SH2）与工程配体肽PGFpYXEAN（来自PLCγ1的X - Y接头，X为带有α - 氯乙酰基的非天然氨基酸）之间的位点特异性共价偶联反应，PGFpYXEAN通过N末端氨基基团固定在NHS活化的琼脂糖树脂上，然后HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白通过SH2结构域与PGFpYXEAN反应，实现HP1β CD在琼脂糖表面的固定。 验证反应：将重组表达和纯化的PLCγ1 - c - SH2和配体肽在PBS中混合，通过质谱证实形成稳定的共价交联；对HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白与BC - k配体肽的反应动力学进行详细研究，发现咪唑能促进共轭反应，且反应具有特异性。 通过BC - k肽共价固定HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2： 将BC - k肽共价偶联到NHS功能化的琼脂糖树脂上，然后加入HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白进行共价偶联反应，量化结果表明融合蛋白中的SH2结构域能有效地与琼脂糖表面展示的BC - k肽反应，且表面展示的HP1β CD蛋白能够结合甲基化赖氨酸含蛋白质。 通过对比实验发现，与利用镍 - 次氮基三乙酸（Ni - NTA）琼脂糖锚定His标签的HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白的方法相比，AGCC共价固定化背景更低，能减少与裂解液蛋白质的非特异性相互作用，且共价锚定能有效防止表面展示蛋白质的泄漏，降低后续质谱分析中噪声肽的水平。 通过共价固定化策略分析MCF - 7细胞中的甲基化组： 利用AGCC展示的HP1β CD与MCF - 7细胞裂解液中HP1β CD蛋白相互作用，对亲和富集的蛋白质进行SDS - PAGE分析、凝胶内消化和质谱分析，鉴定出322种与HP1β CD相关的蛋白质，其中184种是赖氨酸甲基化（Kme）蛋白质，共鉴定出275个不同的赖氨酸甲基化位点，包括101个三甲基化位点、100个二甲基化位点和77个单甲基化位点。 与已知甲基化蛋白质数据库对比，发现AGCC策略能发现更多赖氨酸甲基化蛋白质和位点；对鉴定的赖氨酸甲基化蛋白质进行亚细胞定位和基序分析，发现细胞质蛋白质占多数，且甲基化赖氨酸位点没有明显的主导基序。 研究结论： 开发了基于亲和导向共价偶联（AGCC）的新蛋白质固定化策略，利用工程BC - k肽与PLCγ1 - c - SH2结构域之间的Cys - 氯乙酰基亲核S_N2反应，有效地固定了HP1β CD作为诱饵，用于甲基化赖氨酸蛋白质的蛋白质组分析。 AGCC策略使诱饵蛋白具有均匀的取向，同时保持其结构和活性，有助于生物偶联在AP / MS研究中的应用，推动了蛋白质固定化方法的进步，加速了对更多表观遗传功能的理解。 文献
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