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Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect–based chemical-enrichment method 2022-global-profiling-of-arginine-dimethylation-in-regulating-protein-phase-separation-by-a-steric-effect.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 蛋白质精氨酸甲基化在调节不同细胞过程中蛋白质的结构构象和生理功能方面起着重要作用，其失调可能导致多种人类疾病。最近发现精氨酸甲基化参与调节蛋白质液 - 液相分离（LLPS），驱动不同无膜细胞器（MLOs）的形成，但在蛋白质组水平上对精氨酸甲基化进行全局鉴定和表征以调节蛋白质LLPS和MLO动态组装的研究仍缺乏。 研究方法与内容： 设计SECEM： 开发了一种基于空间位阻效应的化学富集方法（SECEM），用于从复杂肽混合物中富集精氨酸二甲基化肽。该方法利用硼酸盐亲和层析基于硼酸盐与顺式二醇之间的可逆共价相互作用，通过使未甲基化或单甲基化的精氨酸残基与1,2 - 环己二酮反应形成螺环结构，而二甲基化精氨酸残基与丙酮酸醛反应形成顺式二醇，从而实现硼酸盐亲和富集。 评估SECEM的富集性能，通过将携带aDMA或sDMA的合成胰蛋白酶肽与牛血清白蛋白（BSA）的胰蛋白酶消化物混合并进行SECEM富集，结果表明SECEM能够很好地富集aDMA和sDMA形式的精氨酸二甲基化肽。 通过SECEM进行哺乳动物细胞中精氨酸二甲基化的蛋白质组学分析： 应用SECEM从哺乳动物Jurkat T细胞的全蛋白胰蛋白酶消化物中富集精氨酸二甲基化肽，通过耦合“重”甲硫氨酸的代谢标记和IonPEP算法来控制DMA鉴定的置信度，与直接分析全蛋白消化物相比，鉴定到的精氨酸二甲基化肽和DMA位点的数量显著增加。 改进样品制备方案以减少含精氨酸肽的比例，从而识别更多的DMA位点，结果表明SECEM比免疫亲和富集方法具有更高的富集二甲基化肽的效率，且在识别RG/RGG基序内的DMA位点方面表现更优。 对SECEM鉴定的RG/RGG基序内DMA位点进行生物信息学分析，表明这些位点与参与不同MLOs的蛋白质LLPS密切相关。 研究精氨酸甲基化对SG形成和拆卸的影响： 通过用I型PRMT抑制剂和PRMT5抑制剂处理HeLa细胞，实现蛋白质精氨酸甲基化水平的全局下调，观察到SG的平均数量和每个细胞的平均面积显著增加，且SG的动态拆卸受到严重损害，表明抑制全局蛋白质精氨酸甲基化显著促进SG的形成并减少SG的解离。 分析SG形成过程中精氨酸二甲基化的动态变化： 使用SECEM分析SG形成过程中蛋白质组水平上精氨酸二甲基化（DMA）的变化，特别是RG/RGG基序内的DMA，鉴定到一些关键SG包含蛋白（如G3BP1、FUS和hnRNPA1）的DMA水平发生显著变化，且这些甲基化肽都位于RG/RGG富集区域，该区域是对介导蛋白质LLPS至关重要的内在无序区域（IDRs）。 研究RG/RGG富集区域的精氨酸甲基化对蛋白质LLPS的影响： 过表达并纯化了4个不同的RG/RGG富集区域，通过体外精氨酸甲基化实验和LC - MS/MS鉴定，证实这些区域被甲基化，且精氨酸甲基化显著损害了所有4个RG/RGG富集区域的LLPS能力，将11个精氨酸残基突变为丙氨酸后，4个突变体的LLPS能力均严重受损，验证了这些精氨酸残基在介导RG/RGG富集区域LLPS中的重要作用。 讨论： SECEM作为一种化学方法，受甲基化位点附近残基类型的影响较小，能够识别几乎所有天然氨基酸残基旁边和不同基序内的DMA，而免疫亲和方法由于甘氨酸残基对富集的贡献有限，在富集RG/RGG基序内的DMA方面能力较弱。 SECEM数据集优先富集了MLOs，特别是SG中蛋白质的RG/RGG基序内的DMA位点，且精氨酸甲基化对SG包含蛋白（如G3BP1、FUS、hnRNPA1和KHDRBS1）的DMA动态调节对调节SG组装和解组装至关重要，未来可进一步探索精氨酸甲基化是否对其他MLOs中的蛋白质进行动态调节。 材料与方法： 富集合成精氨酸二甲基化肽：制备4种不同精氨酸甲基化形式（未甲基化、MMA、aDMA和sDMA）的肽，并进行相关处理和分析。 细胞培养、小分子处理和SG形成：培养Jurkat T细胞和HeLa细胞，用小分子处理HeLa细胞以诱导SG组装和拆卸。 细胞裂解、蛋白质消化和肽标记：对细胞进行裂解、蛋白质消化和肽标记等处理。 从全蛋白消化物中富集精氨酸二甲基化肽：溶解脱盐后的肽，进行精氨酸二甲基化肽的富集和后续处理。 免疫亲和富集精氨酸二甲基化肽：参照之前描述的程序进行。 基本反相LC进行分级分离：对肽混合物进行分级分离。 MS分析：使用质谱仪分析肽混合物。 数据库搜索：使用MaxQuant软件进行数据库搜索。 IonPEP算法：用于控制精氨酸二甲基化肽鉴定的置信度。 生物信息学分析：使用相关数据库和软件进行分析。 甲基化蛋白质组分析在SG形成期间：提出了依赖于库的甲基化蛋白质组鉴定质量控制方法。 Western Blot分析：对处理后的HeLa细胞进行Western Blot分析。 免疫细胞化学和共聚焦成像：对细胞进行固定、透化、封闭等处理，然后进行成像。 质粒构建、蛋白质表达和纯化：构建相关质粒并在大肠杆菌中表达和纯化蛋白质。 体外精氨酸甲基化实验：进行体外精氨酸甲基化实验。 体外LLPS实验：确定突变位点和精氨酸甲基化对蛋白质LLPS的影响。 数据、材料和软件可用性：质谱数据可通过ProteomeXchange获取，其他数据包含在文章或补充材料中。 研究贡献： 开发了化学富集方法SECEM，用于在蛋白质组水平上分析精氨酸二甲基化（DMA），揭示了DMA在RG/RGG基序内对调节蛋白质LLPS和MLO动态组装的重要作用。 通过SECEM研究了SG形成过程中DMA的动态变化，发现了一些关键SG包含蛋白中DMA的显著变化，并验证了这些蛋白中精氨酸残基在介导LLPS中的重要作用。
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Discovery and Molecular Basis of a Diverse Set of Polycomb Repressive Complex 2 Inhibitors Recognition by EED Li 等 - 2017 - Discovery and Molecular Basis of a Diverse Set of Polycomb Repressive Complex 2 Inhibitors Recogniti.pdf LSH评论1: PRC2是一种抑制复合物，通过使H3K27发生修饰成为H3K27me3，进而染色质结构改变，从而抑制相关基因表达；然而同时H3K27me3激活PRC2活性，使其增强H3K27me3的修饰功能；这一点似乎矛盾，首先H3K27me3从哪里来，如果是组蛋白上的，那么他已经发生Kme3修饰了，激活的PRC2又去修饰谁呢？如果是游离的H3K27me3，那他是从哪里来的，是否存在呢？ LSH评论2：PRC2中EED亚基含有多个WD40结构域，WD40结构域能够结合H3K27me3，在形成PRC2活性催化复合结构[EED和SUZ12的C端+EZH2]起到关键作用；那么当H3K27me3被EED识别后，激活了PRC2，这个激活构想中催化位置在哪？和起到激活作用H3K27me3相对位置如何？ LSH评论3：本文中发现了几个新的抑制剂，能够竞争H3K27me3结合位点，使得PRC2活性催化复合结构[EED和SUZ12的C端+EZH2]改变，不能发挥催化活性，不发挥催化活性那么相关基因[H3K27me3时抑制的基因]就表达了？ AI总结: “Discovery and Molecular Basis of a Diverse Set of Polycomb Repressive Complex 2 Inhibitors Recognition by EED”由Li等人撰写，报道了通过EED识别的多种PRC2抑制剂的发现和分子基础，揭示了这些化合物的结合模式和作用机制，为开发新型PRC2抑制剂提供了结构基础。 研究背景 PRC2的结构和功能：PRC2是一种组蛋白H3赖氨酸27甲基转移酶，在基因调控中起关键作用，是癌症治疗的一个已知表观遗传学药物靶点。其核心复合物由EZH2、EED和SUZ12组成，EED是调节亚基，能结合H3K27me3并刺激PRC2活性。 PRC2抑制剂的研究现状：已有一些PRC2抑制剂被发现，但仍需要开发更有效的抑制剂。 实验方法 蛋白质表达和纯化：将EED克隆到pGEX - KG载体中，在大肠杆菌中表达，通过亲和层析、蛋白酶切割、镍柱和凝胶过滤柱纯化。 高通量筛选和命中筛选：开发了EZH2 HTS生化测定法，筛选了约140万个化合物，通过化学信息学筛选、确认和反筛选，选择了1,967个化合物进行剂量反应滴定，并在多种正交测定中进行验证。 IC50测定：采用基于LC - MS的PRC2生化测定法和EED - H3K27me3 AlphaScreen竞争结合测定法测定化合物的IC50值。 结合分析：通过ITC和SPR实验分析化合物与PRC2的结合常数和结合焓。 结晶和数据收集：采用坐滴气相扩散法结晶EED - 化合物复合物，在上海同步辐射装置收集衍射数据。 结构测定和优化：用分子置换法确定蛋白质结构，手动构建化合物结构，并用REFMAC5和BUSTER进行优化。 实验结果 PRC2酶活性测定及抑制剂筛选 建立了以H3（21 - 44）肽或重组单核小体核心颗粒（NCP）为底物的PRC2酶活性测定方法，研究了PRC2的基础活性和H3K27me3肽的刺激作用。 通过高通量筛选和验证，鉴定出多种H3K27me3竞争性抑制剂，其中5种化合物被选为代表进行进一步研究。 H3K27me3竞争性抑制剂的特性 这些化合物对PRC2具有高度选择性，不抑制其他组蛋白甲基转移酶。 通过ITC和SPR实验验证了这些化合物与EED的直接结合。 EEDi与EED相互作用的分子基础 确定了EED与5种化合物复合物的晶体结构，这些化合物诱导EED的芳香笼残基发生显著的构象变化，形成一个更深的口袋。 所有化合物都与口袋底部的Arg367相互作用，同时每个化合物在与EED的相互作用中也显示出独特的特征。 研究结论 发现了一类新的PRC2变构抑制剂，它们通过与EED结合抑制PRC2的基础活性，并与H3K27me3竞争结合EED。 晶体结构揭示了这些化合物诱导EED的芳香笼残基发生构象变化，形成一个更易成药的口袋。 这些结果为开发针对PRC2的治疗药物提供了新的化学起点。
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Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation Chen et al. - 2024 - Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 乳酸是大多数癌症的代谢标志物，但其在癌细胞中的非代谢功能仍不清楚。最近研究表明乳酸可诱导组蛋白赖氨酸残基的乳酸化修饰，但乳酸化在蛋白质中的作用尚不清楚。 同源重组（HR）是修复DNA双链断裂（DSBs）的重要途径，其过度激活与癌症的化疗耐药性有关。MRE11是HR修复中的关键蛋白，但其DNA结合的调控机制仍不清楚。 研究方法与内容： 乳酸化促进DNA损伤修复和化疗耐药性： 通过检测关键HR蛋白的乳酸化水平，发现MRE11在细胞中被强烈乳酸化，且乳酸化促进DNA损伤修复和化疗耐药性。 用乳酸钠（NALA）处理细胞可增加蛋白质乳酸化，促进DNA损伤修复；乳酸脱氢酶（LDH）抑制剂（LDHi）处理则降低乳酸化水平，抑制HR和化疗耐药性。 低LDHA表达水平的患者HR缺陷（HRD）评分较高，提示高乳酸或蛋白质乳酸化可能在HR修复中起关键作用。 MRE11被CBP乙酰转移酶乳酸化： MRE11的乳酸化由CBP乙酰转移酶介导，且依赖于ATM对CBP的磷酸化。 通过质谱鉴定出MRE11的四个潜在乳酸化位点（K510、K609、K625和K673），其中K673是响应DNA损伤的主要乳酸化位点，且高度保守。 MRE11乳酸化增强其DNA结合能力： MRE11乳酸化不影响其与RAD50和NBS的复合物形成，但促进MRE11或MR（RAD50和MRE11复合物）与双链DNA（dsDNA）和突出DNA的结合，增强MRE11与DNA的结合能力和焦点形成，提高MRE11在染色质上的加载。 MRE11乳酸化增强端切： 乳酸化通过CBP - MRE11轴调节DNA端切，NALA处理增加RPA2、BrdU和RAD51焦点形成，促进DNA端切；LDHi处理和MRE11 K673R突变则抑制DNA端切。 MRE11乳酸化促进HR： MRE11 K673R突变降低HR修复，损伤DNA修复，增加染色体/染色单体断裂；在体内，NALA或CBP抑制剂（CBPi）处理可调节DSB修复，LDHA基因敲除小鼠的实验也证实了这一点。 MRE11乳酸化促进癌细胞的化疗耐药性： 高LDHA表达与BRCA1高表达的肿瘤中较低的HRD评分相关，提示高乳酸或乳酸化可能与BRCA1 WT癌症中增强的HR有关。 MRE11 K673R细胞对奥拉帕尼更敏感，操纵乳酸化使用CBPi或NALA会影响MRE11 WT细胞的化疗反应，但对MRE11 K673R突变细胞无影响。 在结肠癌细胞的实验中，LDHi和CBPi处理使癌细胞对顺铂和奥拉帕尼更敏感，NALA处理则使癌细胞对化疗耐药；在患者衍生的器官样体（PDO）和患者衍生的异种移植（PDX）模型中，抑制MRE11 K673乳酸化可增强化疗效果。 用肽抑制剂抑制MRE11 K673乳酸化增强化疗敏感性： 基于蛋白质PTM的基序设计了融合细胞穿透肽（CPP）的短肽，其中K673 - peptide - 3（K673 - pe）对MRE11乳酸化的抑制作用最强。 K673 - pe可降低MRE11乳酸化、磷酸化RPA2水平，抑制MRE11 K673la和RPA2焦点形成，减少RAD51焦点，下调HR，增强癌细胞对奥拉帕尼和顺铂的敏感性。 在高乳酸化的结肠癌PDX模型中，K673 - pe与奥拉帕尼联合显著增强了化疗介导的癌细胞杀伤效果。 讨论： MRE11的乳酸化由CBP介导，发生在其第二个DNA结合域（DBD）的K673位点，增强了其DNA结合能力和端切作用，从而促进HR修复和化疗耐药性。 CBPi或LDHi与化疗联合可显著减弱HR修复，增加癌症杀伤效果；抑制MRE11 K673乳酸化的肽抑制剂可增强化疗效果。 MRE11的乙酰化由GCN5介导，K609是其主要乙酰化位点，但MRE11乙酰化的功能意义仍需进一步研究，且MRE11乳酸化的精确机制和结构信息有待探索。 研究贡献： 揭示了乳酸化在调节HR中的关键作用，MRE11的乳酸化由CBP介导，K673是主要乳酸化位点，乳酸化增强了MRE11的DNA结合能力、端切和HR修复，促进了癌症的化疗耐药性。 设计了特异性抑制MRE11 K673乳酸化的肽抑制剂，增强了化疗敏感性，为克服癌症的化疗耐药性提供了潜在的治疗策略。
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Assaying proline hydroxylation in recombinant collagen variants by liquid chromatography-mass spectrometry Assaying proline hydroxylation in recombinant collagen variants by liquid chromatography-mass spectrometry.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： 重组胶原蛋白的制备在组织再生、细胞 - 基质相互作用研究和细胞外基质的基础生化和生物物理研究中具有巨大潜力，但面临两个挑战：一是合成编码胶原蛋白的基因，二是在重组系统中进行脯氨酸羟基化。 细菌和酵母表达系统通常不进行脯氨酸羟基化的翻译后修饰，需要对其进行基因改造以产生脯氨酰 - 4 - 羟化酶，但其产生的生物聚合物中脯氨酸羟基化水平较低。 检测4 - 羟基脯氨酸（HYP）具有挑战性，常规的氨基酸分析（AAA）方法需要衍生化，使用放射性同位素的协议也存在不便之处。 研究方法与内容： 开发液相色谱 - 质谱（LC - MS）方法量化脯氨酸和羟基脯氨酸： LC - MS由Agilent 1100仪器和Waters LCT Classic质谱仪组成，使用反相液相色谱分离，电喷雾电离（ESI）正离子模式。 确定标准曲线：使用D - 脯氨酸和反式 - 4 - 羟基 - L - 脯氨酸作为校准标准，甘氨酰苯丙氨酸作为内标，绘制PRO和HYP的校准曲线，线性范围为PRO浓度在0.2μg / ml至5μg / ml之间，HYP浓度在0.2μg / ml至1.5μg / ml之间。 载体和菌株构建：使用酿酒酵母BY4741 - ΔTRP1表达模块化胶原蛋白和人脯氨酰 - 4 - 羟化酶，将人脯氨酰 - 4 - 羟化酶亚基基因p4Ha和p4Hb克隆到低拷贝CEN / ARS载体中，与2μ模块化胶原蛋白质粒共转化到BY4741 - ΔTRP1中，构建不同的胶原 - 羟化酶基因拷贝比的酵母菌株。 胶原蛋白的表达和纯化：携带双质粒的菌株进行培养、裂解，用胃蛋白酶消化背景蛋白，通过阳离子交换色谱纯化重组胶原蛋白。 制备和分析FPLC纯化的胶原蛋白样品：将干燥的牛胶原蛋白和FPLC纯化的重组胶原蛋白样品水解，用LC - MS系统分析。 制备和分析SDS - PAGE纯化的胶原蛋白样品：将胶原蛋白样品进行SDS - PAGE分离，切下胶原蛋白条带，提取胶原蛋白并水解，用LC - MS分析。 计算羟基化百分比：根据LC - MS数据计算脯氨酸的羟基化百分比，AAA分析中扣除背景化学噪声（0.18％）。 评估LC - MS方法： LC - MS方法能够量化脯氨酸和羟基脯氨酸，峰面积比与氨基酸浓度呈线性关系。 LC - MS测定的牛胶原蛋白和重组胶原蛋白的脯氨酸羟基化百分比与AAA方法相当，且精度至少与AAA相当。 SDS - PAGE提取的胶原蛋白样品的羟基化测定结果表明，该方法可用于筛选蛋白质候选物以确定所需的羟基化水平，但基于色谱的纯化可能对于深入分析是必要的。 不同胶原 - 羟化酶基因拷贝比的酵母菌株产生的重组胶原蛋白的羟基化水平不同，当胶原基因拷贝数相对于羟化酶基因较高时，羟基化水平较低，因此需要平衡羟化酶和胶原的表达水平。 结论： 开发了一种用于测定天然和重组来源胶原蛋白的脯氨酸羟基化百分比的LC - MS方法，该方法与常规的氨基酸分析一样准确和精确，可用于评估不同重组酿酒酵母菌株产生的胶原蛋白的羟基化水平。 该方法为筛选具有不同脯氨酸羟基化水平的蛋白质提供了一种快速可靠的分析方法，是对常规氨基酸分析的一种替代方法。 研究贡献： 开发了一种无需衍生化的LC - MS方法来测定重组胶原蛋白中脯氨酸羟基化的水平，该方法使用相对较少的样品量，且不需要复杂的样品处理和衍生化步骤。 通过该方法研究了不同酵母表达系统中基因比例对脯氨酸羟基化程度的影响，发现较高的胶原 - 羟化酶基因拷贝比会导致较低的羟基化百分比，提示需要特定平衡的基因比例来获得更高的羟基化水平。
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HP1-b mobilization promotes chromatin changes that Ayoub et al. - 2008 - HP1-β mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response.pdf AI总结 文章总结： 研究背景： DNA损伤后，组蛋白H2AX会被磷酸化，这是染色体DNA断裂的最早已知标记，而HP1 - β是一种与组蛋白H3甲基化赖氨酸9（H3K9me）结合的染色质因子，其在DNA损伤响应中的作用尚不清楚。 实验内容： 观察HP1 - β在DNA损伤后的动态变化： 通过荧光恢复（FRAP）和荧光漂白损失（FLIP）实验，发现DNA损伤后EGFP - HP1 - β在常染色质和异染色质中的分子迁移率增加，流动性增强。 使用405nm激光精确靶向DNA双链断裂，发现损伤后EGFP - HP1 - β迅速从异染色质焦点分散，且在损伤部位局部的FRAP动力学发生变化，内源HP1 - β也从损伤的异染色质焦点重新排列和分散，并在90分钟内逐渐重新积累。 探究HP1 - β定位和动力学变化的原因： DNA损伤后，组蛋白H3K9me3、H3K4me3、H3乙酰化和H4乙酰化等组蛋白修饰没有明显改变，因此HP1 - β的动员不太可能是组蛋白代码改变导致的，而可能是HP1 - β本身的变化。 通过突变实验，发现HP1 - β染色质结构域中Thr 51的改变（突变为Ala或Glu）会导致EGFP - HP1 - β在细胞核中扩散分布且FRAP动力学快速，而Thr 51在进化上是保守的。 结构模型显示，Thr 51侧链的羟基参与了形成复合物所必需的氢键网络，其磷酸化或取代会破坏该氢键网络，从而使HP1 - β通过H3K9me3与染色质的结合能力减弱。 重组CK2可以磷酸化野生型HP1 - β染色质结构域的Thr 51，但不能磷酸化T51A突变体，且体内实验表明，DNA损伤后HP1 - β（T51P）的形成增加，与HP1 - β的重排和分散模式相似。 化学或遗传抑制CK2活性会抑制HP1 - β在Thr 51的磷酸化和DNA损伤后的动员，而CK2抑制剂TBB会抑制DNA损伤后H2AX的磷酸化。 研究HP1 - β动员对H2AX磷酸化的影响： 通过融合实验，发现HP1 - β与组蛋白H2B融合后使其在染色质上固定，会抑制DNA损伤后γ - H2AX染色的强度，而单独表达EGFP - HP1 - β或H2B - EGFP对γ - H2AX染色没有影响。 结论： DNA损伤后，CK2通过磷酸化HP1 - β的Thr 51使其从染色质中动员出来，从而促进H2AX的磷酸化，这是对染色体断裂响应的最早已知事件。 HP1 - β动员为改变染色质组织提供了一个不寻常的机制示例，它通过靶向组蛋白结合蛋白而不是组蛋白代码本身来促进染色质的快速重塑和有效逆转。 方法总结： 转染：使用Lipofectamine 2000进行转染。 显微镜和激光诱导DNA损伤：通过激光照射诱导DNA损伤，并用γ - H2AX和53BP1染色确认DNA断裂，通过活细胞连续成像观察EGFP标记蛋白的分散情况，或通过固定和免疫染色检测分散的蛋白质，通过光漂白EGFP标记的蛋白质并测量漂白区域的荧光恢复（FRAP）或在重复漂白周期中从远处区域的损失（FLIP）来研究动态交换。 生化测定：使用His、谷胱甘肽S - 转移酶（GST）或抗体介导的下拉实验，以及荧光甲基化Lys 9（K9me）肽与GST - HP1的结合测定。 Western blotting：对标准方法进行修改，使用ImageJ软件通过积分密度测量来量化信号强度。
