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研究背景：
- 蛋白质精氨酸甲基化在调节不同细胞过程中蛋白质的结构构象和生理功能方面起着重要作用，其失调可能导致多种人类疾病。最近发现精氨酸甲基化参与调节蛋白质液 - 液相分离（LLPS），驱动不同无膜细胞器（MLOs）的形成，但在蛋白质组水平上对精氨酸甲基化进行全局鉴定和表征以调节蛋白质LLPS和MLO动态组装的研究仍缺乏。
研究方法与内容：
设计SECEM：
- 开发了一种基于空间位阻效应的化学富集方法（SECEM），用于从复杂肽混合物中富集精氨酸二甲基化肽。该方法利用硼酸盐亲和层析基于硼酸盐与顺式二醇之间的可逆共价相互作用，通过使未甲基化或单甲基化的精氨酸残基与1,2 - 环己二酮反应形成螺环结构，而二甲基化精氨酸残基与丙酮酸醛反应形成顺式二醇，从而实现硼酸盐亲和富集。
- 评估SECEM的富集性能，通过将携带aDMA或sDMA的合成胰蛋白酶肽与牛血清白蛋白（BSA）的胰蛋白酶消化物混合并进行SECEM富集，结果表明SECEM能够很好地富集aDMA和sDMA形式的精氨酸二甲基化肽。
通过SECEM进行哺乳动物细胞中精氨酸二甲基化的蛋白质组学分析：
- 应用SECEM从哺乳动物Jurkat T细胞的全蛋白胰蛋白酶消化物中富集精氨酸二甲基化肽，通过耦合“重”甲硫氨酸的代谢标记和IonPEP算法来控制DMA鉴定的置信度，与直接分析全蛋白消化物相比，鉴定到的精氨酸二甲基化肽和DMA位点的数量显著增加。
- 改进样品制备方案以减少含精氨酸肽的比例，从而识别更多的DMA位点，结果表明SECEM比免疫亲和富集方法具有更高的富集二甲基化肽的效率，且在识别RG/RGG基序内的DMA位点方面表现更优。
- 对SECEM鉴定的RG/RGG基序内DMA位点进行生物信息学分析，表明这些位点与参与不同MLOs的蛋白质LLPS密切相关。
研究精氨酸甲基化对SG形成和拆卸的影响：
- 通过用I型PRMT抑制剂和PRMT5抑制剂处理HeLa细胞，实现蛋白质精氨酸甲基化水平的全局下调，观察到SG的平均数量和每个细胞的平均面积显著增加，且SG的动态拆卸受到严重损害，表明抑制全局蛋白质精氨酸甲基化显著促进SG的形成并减少SG的解离。
分析SG形成过程中精氨酸二甲基化的动态变化：
- 使用SECEM分析SG形成过程中蛋白质组水平上精氨酸二甲基化（DMA）的变化，特别是RG/RGG基序内的DMA，鉴定到一些关键SG包含蛋白（如G3BP1、FUS和hnRNPA1）的DMA水平发生显著变化，且这些甲基化肽都位于RG/RGG富集区域，该区域是对介导蛋白质LLPS至关重要的内在无序区域（IDRs）。
研究RG/RGG富集区域的精氨酸甲基化对蛋白质LLPS的影响：
- 过表达并纯化了4个不同的RG/RGG富集区域，通过体外精氨酸甲基化实验和LC - MS/MS鉴定，证实这些区域被甲基化，且精氨酸甲基化显著损害了所有4个RG/RGG富集区域的LLPS能力，将11个精氨酸残基突变为丙氨酸后，4个突变体的LLPS能力均严重受损，验证了这些精氨酸残基在介导RG/RGG富集区域LLPS中的重要作用。
讨论：
- SECEM作为一种化学方法，受甲基化位点附近残基类型的影响较小，能够识别几乎所有天然氨基酸残基旁边和不同基序内的DMA，而免疫亲和方法由于甘氨酸残基对富集的贡献有限，在富集RG/RGG基序内的DMA方面能力较弱。
- SECEM数据集优先富集了MLOs，特别是SG中蛋白质的RG/RGG基序内的DMA位点，且精氨酸甲基化对SG包含蛋白（如G3BP1、FUS、hnRNPA1和KHDRBS1）的DMA动态调节对调节SG组装和解组装至关重要，未来可进一步探索精氨酸甲基化是否对其他MLOs中的蛋白质进行动态调节。
材料与方法：
- 富集合成精氨酸二甲基化肽：制备4种不同精氨酸甲基化形式（未甲基化、MMA、aDMA和sDMA）的肽，并进行相关处理和分析。
- 细胞培养、小分子处理和SG形成：培养Jurkat T细胞和HeLa细胞，用小分子处理HeLa细胞以诱导SG组装和拆卸。
- 细胞裂解、蛋白质消化和肽标记：对细胞进行裂解、蛋白质消化和肽标记等处理。
- 从全蛋白消化物中富集精氨酸二甲基化肽：溶解脱盐后的肽，进行精氨酸二甲基化肽的富集和后续处理。
- 免疫亲和富集精氨酸二甲基化肽：参照之前描述的程序进行。
- 基本反相LC进行分级分离：对肽混合物进行分级分离。
- MS分析：使用质谱仪分析肽混合物。
- 数据库搜索：使用MaxQuant软件进行数据库搜索。
- IonPEP算法：用于控制精氨酸二甲基化肽鉴定的置信度。
- 生物信息学分析：使用相关数据库和软件进行分析。
- 甲基化蛋白质组分析在SG形成期间：提出了依赖于库的甲基化蛋白质组鉴定质量控制方法。
- Western Blot分析：对处理后的HeLa细胞进行Western Blot分析。
- 免疫细胞化学和共聚焦成像：对细胞进行固定、透化、封闭等处理，然后进行成像。
- 质粒构建、蛋白质表达和纯化：构建相关质粒并在大肠杆菌中表达和纯化蛋白质。
- 体外精氨酸甲基化实验：进行体外精氨酸甲基化实验。
- 体外LLPS实验：确定突变位点和精氨酸甲基化对蛋白质LLPS的影响。
- 数据、材料和软件可用性：质谱数据可通过ProteomeXchange获取，其他数据包含在文章或补充材料中。
研究贡献：
- 开发了化学富集方法SECEM，用于在蛋白质组水平上分析精氨酸二甲基化（DMA），揭示了DMA在RG/RGG基序内对调节蛋白质LLPS和MLO动态组装的重要作用。
- 通过SECEM研究了SG形成过程中DMA的动态变化，发现了一些关键SG包含蛋白中DMA的显著变化，并验证了这些蛋白中精氨酸残基在介导LLPS中的重要作用。
