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文章总结：
研究背景：
- 重组胶原蛋白的制备在组织再生、细胞 - 基质相互作用研究和细胞外基质的基础生化和生物物理研究中具有巨大潜力，但面临两个挑战：一是合成编码胶原蛋白的基因，二是在重组系统中进行脯氨酸羟基化。
- 细菌和酵母表达系统通常不进行脯氨酸羟基化的翻译后修饰，需要对其进行基因改造以产生脯氨酰 - 4 - 羟化酶，但其产生的生物聚合物中脯氨酸羟基化水平较低。
- 检测4 - 羟基脯氨酸（HYP）具有挑战性，常规的氨基酸分析（AAA）方法需要衍生化，使用放射性同位素的协议也存在不便之处。
研究方法与内容：
开发液相色谱 - 质谱（LC - MS）方法量化脯氨酸和羟基脯氨酸：
- LC - MS由Agilent 1100仪器和Waters LCT Classic质谱仪组成，使用反相液相色谱分离，电喷雾电离（ESI）正离子模式。
- 确定标准曲线：使用D - 脯氨酸和反式 - 4 - 羟基 - L - 脯氨酸作为校准标准，甘氨酰苯丙氨酸作为内标，绘制PRO和HYP的校准曲线，线性范围为PRO浓度在0.2μg / ml至5μg / ml之间，HYP浓度在0.2μg / ml至1.5μg / ml之间。
- 载体和菌株构建：使用酿酒酵母BY4741 - ΔTRP1表达模块化胶原蛋白和人脯氨酰 - 4 - 羟化酶，将人脯氨酰 - 4 - 羟化酶亚基基因p4Ha和p4Hb克隆到低拷贝CEN / ARS载体中，与2μ模块化胶原蛋白质粒共转化到BY4741 - ΔTRP1中，构建不同的胶原 - 羟化酶基因拷贝比的酵母菌株。
- 胶原蛋白的表达和纯化：携带双质粒的菌株进行培养、裂解，用胃蛋白酶消化背景蛋白，通过阳离子交换色谱纯化重组胶原蛋白。
- 制备和分析FPLC纯化的胶原蛋白样品：将干燥的牛胶原蛋白和FPLC纯化的重组胶原蛋白样品水解，用LC - MS系统分析。
- 制备和分析SDS - PAGE纯化的胶原蛋白样品：将胶原蛋白样品进行SDS - PAGE分离，切下胶原蛋白条带，提取胶原蛋白并水解，用LC - MS分析。
- 计算羟基化百分比：根据LC - MS数据计算脯氨酸的羟基化百分比，AAA分析中扣除背景化学噪声（0.18％）。
评估LC - MS方法：
- LC - MS方法能够量化脯氨酸和羟基脯氨酸，峰面积比与氨基酸浓度呈线性关系。
- LC - MS测定的牛胶原蛋白和重组胶原蛋白的脯氨酸羟基化百分比与AAA方法相当，且精度至少与AAA相当。
- SDS - PAGE提取的胶原蛋白样品的羟基化测定结果表明，该方法可用于筛选蛋白质候选物以确定所需的羟基化水平，但基于色谱的纯化可能对于深入分析是必要的。
- 不同胶原 - 羟化酶基因拷贝比的酵母菌株产生的重组胶原蛋白的羟基化水平不同，当胶原基因拷贝数相对于羟化酶基因较高时，羟基化水平较低，因此需要平衡羟化酶和胶原的表达水平。
结论：
- 开发了一种用于测定天然和重组来源胶原蛋白的脯氨酸羟基化百分比的LC - MS方法，该方法与常规的氨基酸分析一样准确和精确，可用于评估不同重组酿酒酵母菌株产生的胶原蛋白的羟基化水平。
- 该方法为筛选具有不同脯氨酸羟基化水平的蛋白质提供了一种快速可靠的分析方法，是对常规氨基酸分析的一种替代方法。
研究贡献：
- 开发了一种无需衍生化的LC - MS方法来测定重组胶原蛋白中脯氨酸羟基化的水平，该方法使用相对较少的样品量，且不需要复杂的样品处理和衍生化步骤。
- 通过该方法研究了不同酵母表达系统中基因比例对脯氨酸羟基化程度的影响，发现较高的胶原 - 羟化酶基因拷贝比会导致较低的羟基化百分比，提示需要特定平衡的基因比例来获得更高的羟基化水平。
