研究背景：
- 蛋白质 - 蛋白质相互作用驱动生物大分子的自组装，从而在细胞水平上实现重要的生理功能，而人工宿主 - 客体相互作用可形成超分子复合物，但用超分子复合物模拟蛋白质复合物的功能仍具挑战。
- 葫芦脲[7]（CB[7]）能与某些肽的N末端特异性结合，研究人员利用这一特性构建了蛋白质组装体，并应用于蛋白质纯化等领域。
- 亲和纯化 - 质谱（AP - MS）常用于分析蛋白质的翻译后修饰（PTMs），bait蛋白在亲和纯化中成功固定是关键，但其非共价固定可能会屏蔽bait蛋白的某些结构域，导致信号丢失，且洗脱结合的蛋白质通常需要使用苛刻的条件。
实验内容：
构建超分子蛋白质探针：
- 合成并共价固定CB[7]衍生物于NHS树脂，设计包含N末端Phe - Gly - Gly（FGG）基序的肽，通过CB[7]与N末端Phe的非共价相互作用将肽锚定在树脂上，再与HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白反应，实现HP1β CD结构域在树脂表面的固定展示，形成超分子蛋白质探针。
- 通过荧光实验证明肽 - CB[7]树脂的形成，且CB[7]树脂对HP1β CD - PLCγ1 - c - SH2融合蛋白的负载效率与单域蛋白PLCγ1 - c - SH2相当。
超分子蛋白质探针的亲和下拉实验：
- HP1β CD对甲基化蛋白质具有亲和力，表面展示HP1β CD的超分子蛋白质探针可用于富集和鉴定甲基化蛋白质。
- 实验表明超分子蛋白质探针能有效下拉甲基赖氨酸蛋白，背景信号低，且与Ni - NTA策略的下拉效率相当。
鉴定赖氨酸甲基化位点：
- 通过免疫沉淀和质谱分析，从Hela细胞裂解液中鉴定出255种独特蛋白质和66种不同的赖氨酸甲基化蛋白质，共101个甲基赖氨酸位点。
- 与之前的方法相比，该策略鉴定出的赖氨酸甲基化蛋白质数量显著增加，还发现了一些已知和新的非组蛋白上的赖氨酸甲基化位点，如RPA1 K331的新三甲基化位点，提示赖氨酸甲基化可能与RPA的泛素化有关，调控DNA损伤反应。
- 鉴定的赖氨酸甲基化肽中，甘氨酸在上游位置富集，未发现明显的通用甲基化位点 motif。
伴随的赖氨酸甲基化蛋白质分析：
- 对鉴定的赖氨酸甲基化蛋白质进行基因本体（GO）和KEGG通路功能富集分析，发现它们主要富集在细胞核中，参与表观遗传相关的生物过程，涉及15条显著富集的生物学通路。
- 这些蛋白质与其他修饰蛋白质存在相互作用，甲基化与乙酰化和泛素化的连接性更好。
结论：
- 首次将葫芦脲超分子化学应用于赖氨酸甲基化的蛋白质组学研究，通过共价蛋白反应和位点特异性CB[7] - 肽相互作用，实现了HP1β CD结构域的位点特异性、均匀展示，以及在完全天然条件下小分子竞争性驱动洗脱结合的甲基赖氨酸蛋白，简化了洗脱步骤，降低了背景，确保了高信噪比。
- 该方法有望在蛋白质诱饵的固定中普遍适用，新发现的含甲基赖氨酸的蛋白质、新的甲基赖氨酸位点及其参与的生物学通路将为生物学家提供启示，对未来研究蛋白质赖氨酸甲基化的功能具有重要意义。
方法：
- 材料和仪器：材料包括CB[7]、Fmoc保护的氨基酸、Rink酰胺树脂等；仪器包括RP - HPLC、MALDI - TOF质谱仪、凝胶成像系统等。
- 合成CB[7] - NH2：通过一系列反应从葫芦脲合成CB[7] - NH2。
- 肽合成：采用固相肽合成技术合成肽。
- HP1β CD - PLCγ1 - SH2融合蛋白的制备：通过DNA重组技术将HP1β CD - PLCγ1 - SH2质粒插入大肠杆菌表达载体，诱导表达并纯化蛋白。
- Hela细胞裂解及蛋白质下拉：使用HP1β CD-PLCγ1-c-SH2-肽-CBx
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