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研究背景：
- 3 - 羟基脯氨酸（3 - Hyp）是胶原特有的一种罕见的翻译后修饰，其生理作用尚不清楚，但近期研究表明其在原纤维组装中具有功能，并与某些疾病相关。
- 目前对3 - Hyp的生理和病理作用尚无直接证据，且关于年龄对其影响的研究较少。
实验方法：
- 提取和纯化组织胶原：从不同月龄的大鼠皮肤、骨骼和尾肌腱以及牛的跟腱中提取和纯化胶原。
- 制备稳定同位素标记的胶原（SI - collagen）：从成纤维细胞培养物中制备，作为内部标准用于高精度胶原分析。
- 总胶原脯氨酸3 - 羟基化分析：通过LC - MS分析酸水解后的胶原样品，以SI - collagen为内标，计算3 - Hyp的相对含量和绝对含量。
- 位点特异性分析：对胶原样品进行胰蛋白酶消化，通过LC - MS分析胰蛋白酶肽段，鉴定3 - Hyp位点，并半定量估计每个修饰位点脯氨酸3 - 羟基化的相对丰度。
- N - 末端氨基酸序列分析：对含有新鉴定的3 - Hyp位点的胰蛋白酶肽段进行N - 末端氨基酸序列分析，以验证3 - Hyp的存在。
实验结果：
- 3 - Hyp在肌腱胶原中增加：在大鼠尾肌腱胶原中，3 - Hyp在出生后3个月内显著增加，随后保持稳定，而皮肤和骨骼胶原中未观察到明显增加。
- 发现肌腱中I型胶原的新3 - Hyp位点：通过LC - MS在大鼠尾肌腱I型胶原中鉴定出Pro716和Pro719为新的3 - Hyp位点，并验证了其存在。
- 脯氨酸3 - 羟基化在肌腱I型胶原特定位点增加：在大鼠尾肌腱I型胶原中，Pro986几乎完全羟基化，而Pro707、Pro716和Pro719的脯氨酸3 - 羟基化水平在幼鼠和成年鼠之间存在显著差异，且在幼龄时显著增加。皮肤和骨骼I型胶原中未检测到Pro716和Pro719的羟基化。牛肌腱中也观察到了类似的脯氨酸3 - 羟基化随年龄的变化。
- 确保肌腱胶原样品的纯度：通过监测I型胶原α2链中Pro891的潜在羟基化情况，确认了肌腱样品为纯肌腱胶原。
讨论：
- 3 - Hyp在大鼠尾肌腱中在特定年龄段的连续修饰位点（包括Pro707、Pro716和Pro719）显著增加，这种增加与肌腱的组织发育相关，而不是与衰老相关。
- 3 - Hyp可能参与胶原原纤维的组装，对原纤维直径的调节起增量作用，肌腱中独特的组织特异性特性可能部分源于发育早期脯氨酸3 - 羟基化的改变。
- 推测Pro716和Pro719由P3H2在Pro707羟基化后修饰，负责不同位点羟基化的P3H酶的差异可能导致了不同的结果。
- 皮肤、骨骼和尾肌腱中羟赖氨酸的糖基化也有显著变化，进一步的位点特异性分析可能会有新的发现。
- 3 - Hyp在胶原中的水平显示出个体变异性，且相对容易响应生理和病理条件而改变，可能负责结缔组织机械/结构特性的时间调节，其水平可能是组织胶原质量状态的指标。
- 结论：本研究表明脯氨酸3 - 羟基化在组织、发育阶段和修饰位点上具有特异性改变，暗示其在组织中起关键作用，但3 - Hyp增加在肌腱中的生物学意义仍有待阐明，需要进一步的研究。
